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Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening

文章雜志：Nature Protocols
影響因子：14.8
文章單位：Protocols
發表年份：2017年

一、研究背景

早期的基因筛选方法依赖于化学 DNA 诱变剂来诱导遗传变化PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2杏耀平台|杏耀注册|杏耀登录|杏耀官网，但此过程效率低下kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站杏耀平台|杏耀注册|杏耀登录|杏耀官网PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce，突变识别成本高昂PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2HOME_U8国际_U8共创美好未来。使用 RNA 干扰技术扰乱转录水平的筛选方法促成许多生物学研究进展PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAceHOME_U8国际_U8共创美好未来意昂凯捷4（中国）官网「强保障平台,更省心娱乐」，但这种方法可能受到转录物的不完全敲除和高脱靶活性的阻碍杏耀平台|杏耀注册|杏耀登录|杏耀官网K8·凯发集团【China版权】官方网站登录入口HOME_U8国际_U8共创美好未来。目前意昂凯捷4（中国）官网「强保障平台,更省心娱乐」，CRISPR/Cas9 技术通过将 Cas9 蛋白与汇集的 sgRNA 文库组合用于基因组规模筛选K8·凯发集团【China版权】官方网站登录入口杏耀平台|杏耀注册|杏耀登录|杏耀官网沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2。本研究描述了使用 CRISPR-Cas9 技术进行基因组规模敲除和转录激活筛选的方案PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce。

二、技術路線

19,050個人類或20,611個小鼠編碼基因
杏耀平台|杏耀注册|杏耀登录|杏耀官网熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2，每個基因6個sgRNA

構建GeCKO文庫

靶點深度測序及分析

候選基因驗證

12,430個人類或23,439小鼠沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2杏耀平台|杏耀注册|杏耀登录|杏耀官网，
每個基因3個sgRNA

構建SAM文庫

靶點深度測序及分析

候選基因驗證
1. 文库设计
（1）根据已知的 sgRNA 靶向规则PG(中国电子)股份有限公司-PG智能科技智慧平台熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce，识别出 sgRNA 文库中感兴趣的基因组区域PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAcePG(中国电子)股份有限公司-PG智能科技智慧平台熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站。
（2）sgRNA 选择：最小 Off-target；最大 on-target；GC 含量；避免均聚物延伸熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站。
2. CRISPR 敲除文库（GeCKO）及转录激活文库（SAM）
3. 测序PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce，分析方法
用 NextSeq 或 HiSeq 进行测序PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce，文库中每个 sgRNA 的读取量大于100 reads 的覆盖率；分析方法有 RIGER、RSA、MAGeck 和 STARS意昂凯捷4（中国）官网「强保障平台,更省心娱乐」kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站，本文使用 RIGER 分析K8·凯发集团【China版权】官方网站登录入口。
4. 候選基因驗證
（1）表型验证：扩增候选基因上的靶点序列HOME_U8国际_U8共创美好未来PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce杏耀平台|杏耀注册|杏耀登录|杏耀官网，进行 NGS 测序并统计 Indel 频率熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce。
（2）蛋白表达验证：western blot 或者免疫组化K8·凯发集团【China版权】官方网站登录入口PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce。

四、研究結論

该研究提供了确定筛选参数和保持足够覆盖率的指南PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce意昂凯捷4（中国）官网「强保障平台,更省心娱乐」。为了验证筛选到的候选基因沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2意昂凯捷4（中国）官网「强保障平台,更省心娱乐」HOME_U8国际_U8共创美好未来，研究者进一步描述了通过分析 indel 率和转录激活来确定筛选表型以及遗传扰动的策略kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站杏耀平台|杏耀注册|杏耀登录|杏耀官网。

案例二用于人类细胞功能基因组学的 CRISPR/Cas9 文库的高通量筛选

High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells

文章雜志：Nature
影響因子：64.8
文章單位：北京大學生命科學學院
發表年份：2014年

一、研究背景

近几年来U8国际「强保障平台,让娱乐更有趣!」HOME_U8国际_U8共创美好未来，基因编辑大大改变了科研人员在哺乳动物系统中研究基因及其功能的方式沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2PG(中国电子)股份有限公司-PG智能科技智慧平台。CRISPR/Cas 系统最初被发现是细菌和古细菌为抵御病毒和质粒不断攻击而演化来的一种获得性免疫防御机制沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2意昂凯捷4（中国）官网「强保障平台,更省心娱乐」PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce。在 II 型 CRISPR/Cas 系统中U8国际「强保障平台,让娱乐更有趣!」，Cas9 内切酶家族在单导向 RNA （single-guide RNA杏耀平台|杏耀注册|杏耀登录|杏耀官网沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2U8国际「强保障平台,让娱乐更有趣!」，sgRNA）引导下靶向和剪切外源基因kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站杏耀平台|杏耀注册|杏耀登录|杏耀官网，生成 DNA 双链断裂（DSBs）HOME_U8国际_U8共创美好未来PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAcekg体育官网视讯(中文站) - 官方网站。该研究利用这种有效的基因编辑技术和简单的程序可编程性K8·凯发集团【China版权】官方网站登录入口熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站，开发了一种利用基于功能的基因筛选来实现基因鉴定的方法K8·凯发集团【China版权】官方网站登录入口沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2意昂凯捷4（中国）官网「强保障平台,更省心娱乐」。

二、技術路線

文庫構建

篩選及檢測

數據分析

291个靶基因kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站意昂凯捷4（中国）官网「强保障平台,更省心娱乐」，大多数基因设计3个gRNAPG(中国电子)股份有限公司-PG智能科技智慧平台HOME_U8国际_U8共创美好未来，利用Golden Gate构建sgRNA慢病毒载体杏耀平台|杏耀注册|杏耀登录|杏耀官网kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站意昂凯捷4（中国）官网「强保障平台,更省心娱乐」， sgRNA 文库慢病毒感染沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站。

筛选处理后的细胞沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2U8国际「强保障平台,让娱乐更有趣!」， PCR 扩增 sgRNAPG(中国电子)股份有限公司-PG智能科技智慧平台，
HiSeq 2500高通量测序

sgRNA 富集统计
靶基因的富集
候選基因驗證

三、研究結果

1. 筛选 PA/LFnDTA 和白喉毒素（DT）毒性的必要基因

高通量测序在对照组中检测到863种（占总量99.3％）sgRNAs熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2，在三轮毒素处理后U8国际「强保障平台,让娱乐更有趣!」杏耀平台|杏耀注册|杏耀登录|杏耀官网，sgRNA 的组成和读数显示在两种不同筛选之间存在明显差异U8国际「强保障平台,让娱乐更有趣!」沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2，大多数 sgRNA 在两种情况下都被消耗HOME_U8国际_U8共创美好未来意昂凯捷4（中国）官网「强保障平台,更省心娱乐」K8·凯发集团【China版权】官方网站登录入口。研究者选择了靶向 PA/LFnDTA 筛选的19个基因的21个 sgRNA 和靶向白喉毒素筛选的15个基因的 15个 sgRNAs 作为研究的潜在候选者熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站PG(中国电子)股份有限公司-PG智能科技智慧平台PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce，从 PA/LFnDTA 和白喉毒素筛选中分别筛选出炭疽毒素受体基因 ANTXR1 和白喉毒素受體基因 HBEGFK8·凯发集团【China版权】官方网站登录入口。

2. 候选基因的遗传验证

研究者使用 XTT 细胞活力和 LDH 细胞死亡试验kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站，检测了所有三个突变体克隆对这两种毒素的敏感性沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce意昂凯捷4（中国）官网「强保障平台,更省心娱乐」，HeLa ANTXR^-/- 和 HeLa HBEGF^-/- 对 PA 和白喉毒素介导的毒性产生了完全的抗性HOME_U8国际_U8共创美好未来。
爲確定本研究的篩選是否揭示了與兩種毒素中毒機制有關的新基因kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce，選擇了富集程度較多的基因並測試了它們産生耐氧表型的能力K8·凯发集团【China版权】官方网站登录入口杏耀平台|杏耀注册|杏耀登录|杏耀官网，PLXNA1、 FZD10、PECR 和 CD81 被证实是参与 PA 介导的炭疽毒性的潜在功能候选基因沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2。而且作者选择了 PECR 基因进行进一步的广泛研究K8·凯发集团【China版权】官方网站登录入口，在 HeLa 细胞获得的两个独立克隆中K8·凯发集团【China版权】官方网站登录入口，PECR 的完全丧失增加了对 PA/LFnDTA 的抗性水平熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站，但对白喉毒素没有影响杏耀平台|杏耀注册|杏耀登录|杏耀官网沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2。

四、研究結論

本研究利用文库功能筛查结合高通量测序分析K8·凯发集团【China版权】官方网站登录入口kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2，成功地鉴别出了对于炭疽和白喉毒素毒性至关重要的宿主基因PG(中国电子)股份有限公司-PG智能科技智慧平台K8·凯发集团【China版权】官方网站登录入口HOME_U8国际_U8共创美好未来，并在随后的细胞实验中对这些候选基因进行了进一步的功能验证熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站K8·凯发集团【China版权】官方网站登录入口意昂凯捷4（中国）官网「强保障平台,更省心娱乐」。这种强大的基因筛选策略的广泛应用PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce，不仅会促进细菌毒素重要基因的快速鉴定熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站K8·凯发集团【China版权】官方网站登录入口PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce，而且还能发现参与其他生物过程的基因kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站K8·凯发集团【China版权】官方网站登录入口。

參考文獻

[1] Joung J, Konermann S, Gootenberg J S, et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening[J]. Nature Protocols, 2017, 12(4):828-863.
[2] Zhou Y, Zhu S, Cai C, et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells[J]. Nature, 2014, 509(2):487-491.

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案例二 用于人类细胞功能基因组学的 CRISPR/Cas9 文库的高通量筛选

案例二用于人类细胞功能基因组学的 CRISPR/Cas9 文库的高通量筛选