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Activation of recombinases at specific DNA loci by zinc-finger domain insertions

期刊：Nature Biotechnology
影響因子：46.9
發表單位：德國德累斯頓技術大學
發表年份：2024年1月

一、研究背景

與核酸酶和其他編輯酶相比HOME_U8国际_U8共创美好未来PG电子·(中国China)官方网站，重組酶作爲基因組編輯工具有幾個潛在的優勢杏宇注册登录-平台官网意昂体育5 -Kgame〈官方认证〉意昂5登录即享,美好时光，但對它們進行工程設計以有效地重組預定的DNA靶標的過程需要大量的時間和勞動投資long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce。

二、研究結果

1N端和C端的ZF融合提高了重組酶的活性
結果表明熊猫体育【中文官方】网站 - 最全赛事直播平台杏宇注册登录-平台官网，與非融合重組酶相比PG电子·(中国China)官方网站，連接子長度、靶點間距和方向的最佳組合顯示出更高的重組率熊猫体育【中文官方】网站 - 最全赛事直播平台杏宇注册登录-平台官网，這可能是因爲ZFD與其位點的結合提供了對DNA的額外親和力球客岛-足球篮球赛事直播平台long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口HOME_U8国际_U8共创美好未来。N-末端和C-末端文庫的活性都得到了最大的提高PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAceHOME_U8国际_U8共创美好未来，當連接子的重複數爲12×GGS九游会·J9-中国官方网站|真人游戏第一品牌，LOXBTR和ZIF結合基序之間的間隔子長度爲5?BP熊猫体育【中文官方】网站 - 最全赛事直播平台PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce，在低重組酶表達水平的質粒試驗中對最佳組合的測試顯示PG电子·(中国China)官方网站，平均重組效率爲85%(C-末端Brec1-Zif268在loxBTR-5-ZIF(A)位點融合)意昂体育5 -Kgame〈官方认证〉意昂5登录即享,美好时光熊猫体育【中文官方】网站 - 最全赛事直播平台熊猫体育「中国Panda」直播认证官方网站，而WT-Brec1在相同條件下平均重組質粒爲7%(圖1e-g)HOME_U8国际_U8共创美好未来熊猫体育「中国Panda」直播认证官方网站熊猫体育【中文官方】网站 - 最全赛事直播平台。因此HOME_U8国际_U8共创美好未来球客岛-足球篮球赛事直播平台long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口，ZFD的融合顯著提高了工程重組酶的重組效率球客岛-足球篮球赛事直播平台熊猫体育【中文官方】网站 - 最全赛事直播平台九游会·J9-中国官方网站|真人游戏第一品牌。
2. Cre-型重组酶五肽扫描诱变
繪制讀數圖顯示long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce，Cre中的插入在許多位置都是耐受的意昂体育5 -Kgame〈官方认证〉意昂5登录即享,美好时光熊猫体育「中国Panda」直播认证官方网站PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce，反映了該酶對插入突變的穩健性PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce球客岛-足球篮球赛事直播平台。相反HOME_U8国际_U8共创美好未来PG电子·(中国China)官方网站杏宇注册登录-平台官网，Cre衍生的重組酶沒有表現出相同的模式熊猫体育【中文官方】网站 - 最全赛事直播平台HOME_U8国际_U8共创美好未来PG电子·(中国China)官方网站，更少的區域允許插入這五個氨基酸球客岛-足球篮球赛事直播平台PG电子·(中国China)官方网站杏宇注册登录-平台官网。然而PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce，Cre、Brec1、D7L和D7R的活性突變體在蛋白質的相同區域含有插入球客岛-足球篮球赛事直播平台，表明這些區域是潛在的通用插入位點九游会·J9-中国官方网站|真人游戏第一品牌熊猫体育「中国Panda」直播认证官方网站。
3.插入式ZFD融合産生依賴于ZF的重組酶
在基于质粒的试验中测试了Zif268 与 8×GGS 连接子融合的最佳变体熊猫体育「中国Panda」直播认证官方网站熊猫体育【中文官方】网站 - 最全赛事直播平台HOME_U8国际_U8共创美好未来，以下简称为 Brec1278-Zif268PG电子·(中国China)官方网站PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce。与筛选结果一致的是球客岛-足球篮球赛事直播平台HOME_U8国际_U8共创美好未来九游会·J9-中国官方网站|真人游戏第一品牌，即使在 200 ?g ml-1 ?-arabinose 的高诱导水平下杏宇注册登录-平台官网熊猫体育【中文官方】网站 - 最全赛事直播平台PG电子·(中国China)官方网站，Brec1278-Zif268 融合体在wt loxBTR上的活性也受到了影响HOME_U8国际_U8共创美好未来，但在 loxBTR-5-zif (B) 位点上却恢复了全部活性球客岛-足球篮球赛事直播平台熊猫体育【中文官方】网站 - 最全赛事直播平台。因此意昂体育5 -Kgame〈官方认证〉意昂5登录即享,美好时光HOME_U8国际_U8共创美好未来熊猫体育「中国Panda」直播认证官方网站，插入式 ZFD 融合产生的重组酶依赖于 ZFD 与其目标序列的结合而具有重组活性PG电子·(中国China)官方网站PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce。
4.基因组位点 ZFD 的设计和定向进化
測試了單體（D7L和D7R）與設計的ZFD在相應對稱位點（loxF8L和loxF8R）以及包括20個堿基對基因組側翼序列的擴展版本（loxF8L-flank和loxF8R-flank）上的融合體的活性九游会·J9-中国官方网站|真人游戏第一品牌HOME_U8国际_U8共创美好未来。與之前的結果一致熊猫体育【中文官方】网站 - 最全赛事直播平台，沒有任何被測試的複合物在loxF8L和loxF8R上顯示活性九游会·J9-中国官方网站|真人游戏第一品牌球客岛-足球篮球赛事直播平台。相反long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口PG电子·(中国China)官方网站，兩個融合體（D7L-ZFL1和D7R-ZFR4）在擴展的目標位點上顯示了活性熊猫体育「中国Panda」直播认证官方网站球客岛-足球篮球赛事直播平台long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口，盡管與非融合的重組酶相比效率較低球客岛-足球篮球赛事直播平台熊猫体育「中国Panda」直播认证官方网站PG电子·(中国China)官方网站。爲了改進設計的ZFDs熊猫体育【中文官方】网站 - 最全赛事直播平台PG电子·(中国China)官方网站九游会·J9-中国官方网站|真人游戏第一品牌，采用成熟的底物連接的定向進化（SLiDE）協議來進行ZFDs的定向進化熊猫体育【中文官方】网站 - 最全赛事直播平台PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce。創建了隨機突變的ZFL1和ZFR4的文庫杏宇注册登录-平台官网HOME_U8国际_U8共创美好未来PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce，並將這些文庫克隆到一個修改過的進化載體中PG电子·(中国China)官方网站熊猫体育【中文官方】网站 - 最全赛事直播平台，其中包含重組酶序列和相應的目標位點球客岛-足球篮球赛事直播平台PG电子·(中国China)官方网站。進行了20個循環的突變、選擇和反選擇long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口意昂体育5 -Kgame〈官方认证〉意昂5登录即享,美好时光，以改善ZFD與側翼位點的特異性結合杏宇注册登录-平台官网，並觀察到最終文庫在擴展的目標位點上的重組活性顯著增加九游会·J9-中国官方网站|真人游戏第一品牌，表明具有改進特性的ZFDs已經進化出來球客岛-足球篮球赛事直播平台。
5.D7-ZF 具有更好的应用性能
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6.ZFD-重組酶融合具有寬松的特異性
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三、研究結論

該研究結果對未來的基因組編輯應用具有重要意義PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce熊猫体育「中国Panda」直播认证官方网站九游会·J9-中国官方网站|真人游戏第一品牌，特別是在開發具有寬松特異性的工程重組酶PG电子·(中国China)官方网站熊猫体育「中国Panda」直播认证官方网站PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce，可以針對多個位點熊猫体育「中国Panda」直播认证官方网站。本文中寬松特異性重組酶RecFlex是這類酶的原型熊猫体育【中文官方】网站 - 最全赛事直播平台PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAcelong8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口。雖然RecFlex目前不能成爲一種完全可編程的重組酶HOME_U8国际_U8共创美好未来杏宇注册登录-平台官网，但我們設想意昂体育5 -Kgame〈官方认证〉意昂5登录即享,美好时光熊猫体育【中文官方】网站 - 最全赛事直播平台，放松特異性重組酶庫的篩選將識別出可以覆蓋人類基因組任何序列的酶HOME_U8国际_U8共创美好未来熊猫体育【中文官方】网站 - 最全赛事直播平台，並可以與插入的ZFD結合生成先進的基因組編輯酶杏宇注册登录-平台官网PA视讯(中文站) - 官方网站PlayAce。

四、參考文獻

Mukhametzyanova L, Schmitt LT, Torres-Rivera J, Rojo-Romanos T, Lansing F, Paszkowski-Rogacz M, Hollak H, Brux M, Augsburg M, Schneider PM, Buchholz F. Activation of recombinases at specific DNA loci by zinc-finger domain insertions. Nat Biotechnol. 2024 Jan 31. doi: 10.1038/s41587-023-02121-y. Epub ahead of print. PMID: 38297187.