陸軍軍醫大學在Molecular Cancer（IF=41.444）杂志上发表了题为“Demethylase ALKBH5 suppresses invasion of gastric cancer via PKMYT1 m6A modification”的研究性论文球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口，该研究建立了一个ALKBH5-PKMYT1-IGF2BP3的转移调控系统澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)官方网站U8国际·科技赋能场景,更省心娱乐，为胃癌转移提供了一个新的治疗靶点U8国际·科技赋能场景,更省心娱乐。諾禾致源在此承担m6A的测序工作DB旗舰·(中国区)官方app网站有限公司官网。

研究背景 

研究表明澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)官方网站，胃癌（gastric carcinoma杏宇娱乐-杏宇注册登录平台球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口，以下简称GC）的表观遗传变化与其侵袭和转移能力密切相关^[1-2]U8国际·科技赋能场景,更省心娱乐熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站。已有研究報道：m6A 修飾參與包括GC在內的各種腫瘤的腫瘤進展過程^[3-5]在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)官方网站熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站，在GC研究中杏耀平台娱乐注册(全站)登录入口手机APP下载杏宇娱乐-杏宇注册登录平台，大多數主要從甲基轉移酶的角度研究了胃癌細胞侵襲和轉移的機制^[6-8], 但对去甲基酶參與胃癌細胞侵襲和轉移的具體分子機制尚未完全闡明U8国际·科技赋能场景,更省心娱乐熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站。

研究思路

研究內容

1.MeRIP-seq：m6A修飾的基因與GC細胞粘附有很強的相關性；去甲基化酶ALKBH5下調與GC預後相關

GC組織的MeRIP-seq發現m6A信號主要出現在mRNA轉錄本的終止密碼子和3'UTR附近（Peak在mRNA轉錄本功能區域上的分布）杏XC彩sport·(中国)集团娱乐官方网站登录入口全站版在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅，m6A修飾集中在GGACU基序上（Motif分析）杏耀平台娱乐注册(全站)登录入口手机APP下载球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅。大多數在GC組織中表現出較高水平的m6A修飾（差異分析）球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口杏耀平台娱乐注册(全站)登录入口手机APP下载熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站，GO分析表明這些基因主要富集在細胞-細胞粘附和上皮細胞遷移中（功能富集分析）杏耀平台娱乐注册(全站)登录入口手机APP下载杏宇娱乐-杏宇注册登录平台。與此同時杏耀平台娱乐注册(全站)登录入口手机APP下载，這些基因的mRNA水平也明顯高于鄰近正常組織杏宇娱乐-杏宇注册登录平台DB旗舰·(中国区)官方app网站有限公司官网沐鸣2-科技赋能场景,让娱乐更有趣!。（MeRIP-seq與mRNA關聯分析）澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)官方网站沐鸣2-科技赋能场景,让娱乐更有趣!。（上述分析内容諾禾致源均可实现）

利用TCGA數據庫（研究m6A 相關酶和遷移相關基因之間的相關性）、結合mRNA-seq數據以及對應的臨床數據熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站，發現ALKBH5在胃癌組織中表達明顯降低在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅，且與臨床腫瘤遠處轉移和淋巴結轉移有關杏耀平台娱乐注册(全站)登录入口手机APP下载。表明ALKBH5的低表達可能是胃癌轉移的根源熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站，可能是參與細胞遷移的關鍵去甲基化酶球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口DB旗舰·(中国区)官方app网站有限公司官网。

圖1 MeRIP-seq揭示m6A與細胞黏附的相關性

2.ALKBH5體外功能研究：在體外抑制GC的侵襲和遷移

Transwell實驗及傷口愈合實驗發現過表達ALKBH5顯著抑制了GC細胞的遷移能力杏耀平台娱乐注册(全站)登录入口手机APP下载杏XC彩sport·(中国)集团娱乐官方网站登录入口全站版，而幹擾ALKBH5表達促進了GC細胞轉移杏耀平台娱乐注册(全站)登录入口手机APP下载，進一步闡明m6A 去甲基化酶ALKBH5在細胞遷移中的作用沐鸣2-科技赋能场景,让娱乐更有趣!，且這種作用與ALKBH5的去甲基酶活性密切相關

3.ALKBH5下遊靶標基因的鑒定：PKMYT1

构建ALKBH5过表达细胞系沐鸣2-科技赋能场景,让娱乐更有趣!DB旗舰·(中国区)官方app网站有限公司官网，通过RNA-seq鉴定ALKBH5在GC转移过程中的潜在靶基因杏耀平台娱乐注册(全站)登录入口手机APP下载在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站。在ALKBH5过表达细胞系中大部分与粘性相关的基因下调；结合MeRIP-seq筛选的GC组织中m6A 水平上调的基因沐鸣2-科技赋能场景,让娱乐更有趣!在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅，共筛选出237个共有基因杏耀平台娱乐注册(全站)登录入口手机APP下载澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)官方网站球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口。通过GEPIA数据库筛选GC组织中表达量上调的基因U8国际·科技赋能场景,更省心娱乐杏耀平台娱乐注册(全站)登录入口手机APP下载，结合已有文献以及MeRIP-qRT-PCRDB旗舰·(中国区)官方app网站有限公司官网沐鸣2-科技赋能场景,让娱乐更有趣!球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口，最终筛选出ALKBH5的靶标基因PKMYT1（磷酸化蛋白激酶）DB旗舰·(中国区)官方app网站有限公司官网球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口。在SGC-7901细胞中杏耀平台娱乐注册(全站)登录入口手机APP下载在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅，干扰ALKBH5 使PKMYT1的m6A 修饰水平和表达水平增加；过表达ALKBH5使PKMYT1的表达水平下降澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)官方网站。RIP-seq和RNA pull down实验证明PKMYT1的转录本能够与ALKBH5结合球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口。另外熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站沐鸣2-科技赋能场景,让娱乐更有趣!球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口，组织微阵列（TMA）和TCGA数据库中的数据也证明GC组织中PKMYT1高表达杏宇娱乐-杏宇注册登录平台U8国际·科技赋能场景,更省心娱乐，且与不良预后密切相关；细胞侵袭实验证明过表达/抑制PKMYT1可增强/减弱了GC细胞的转移能力球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站，且过表达PKMYT1恢复了由于过表达ALKBH5导致的细胞转移能力的减弱球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口，反之亦然在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅。因此U8国际·科技赋能场景,更省心娱乐杏宇娱乐-杏宇注册登录平台在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅，PKMYT1作为ALKBH5的下游靶点杏宇娱乐-杏宇注册登录平台杏耀平台娱乐注册(全站)登录入口手机APP下载，可以促进GC的侵袭和迁移U8国际·科技赋能场景,更省心娱乐熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站。

圖2 靶基因篩選過程

4.PKMYT1功能探究：以m6A依賴的方式促進GC的侵襲和遷移

使用SRAMP网站预测PKMYT1的mRNA序列中具有非常高置信度的五个潜在m6A 修饰位点并利用MeRIP-qPCR进行验证球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)官方网站，结果表明：与正常组织相比DB旗舰·(中国区)官方app网站有限公司官网，GC组织中两个位点的m6A 修饰水平显著升高球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口杏宇娱乐-杏宇注册登录平台在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅，过表达ALKBH5导致这两个位点m6A 水平显著降低DB旗舰·(中国区)官方app网站有限公司官网熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅，而当ALKBH5脱甲基化酶活性的残基突变后它们的m6A 水平得到恢复澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)官方网站DB旗舰·(中国区)官方app网站有限公司官网沐鸣2-科技赋能场景,让娱乐更有趣!。敲除ALKBH5后观察到相反的结果熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站杏XC彩sport·(中国)集团娱乐官方网站登录入口全站版。由此表明PKMYT1 mRNA上的两个位点可能是ALKBH5调控的特定位点杏宇娱乐-杏宇注册登录平台沐鸣2-科技赋能场景,让娱乐更有趣!。GC组织的MeRIP-seq测序中IGV分析表明:与正常组织相比熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站DB旗舰·(中国区)官方app网站有限公司官网杏XC彩sport·(中国)集团娱乐官方网站登录入口全站版，GC中这两个位点的m6A 修饰水平明显更高；此外球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口DB旗舰·(中国区)官方app网站有限公司官网杏宇娱乐-杏宇注册登录平台，PKMYT1在ALKBH5 H204A中明显下调澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)官方网站在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅杏XC彩sport·(中国)集团娱乐官方网站登录入口全站版。对两位点进行突变U8国际·科技赋能场景,更省心娱乐澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)官方网站在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅，突变后PKMYT1整体表达水平降低U8国际·科技赋能场景,更省心娱乐，GC转移能力显著降低沐鸣2-科技赋能场景,让娱乐更有趣!。这种现象在ALKBH5敲低后更为明显在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅杏XC彩sport·(中国)集团娱乐官方网站登录入口全站版。因此杏宇娱乐-杏宇注册登录平台澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)官方网站，研究认为PKMYT1以m6A 依赖的方式促进GC的入侵和迁移杏XC彩sport·(中国)集团娱乐官方网站登录入口全站版杏耀平台娱乐注册(全站)登录入口手机APP下载。

圖3 ALKBH5通過其m6A依賴性方式調節PKMYT1

5.m6A阅读蛋白IGF2BP3通过其m6A修饰位点帮助维持PKMYT1 mRNA的稳定性

RNA pulldown实验和質譜分析确定了PKMYT1 m6A 修饰中潜在的阅读蛋白IGF2BP3（胰岛素样生长因子II mRNA结合蛋白3）在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅杏耀平台娱乐注册(全站)登录入口手机APP下载，结合RIP-seq、组织微阵列和TCGA数据库分析验证发现IGF2BP3和PKMYT1在GC中的表达显著正相关球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅DB旗舰·(中国区)官方app网站有限公司官网，干扰IGF2BP3后球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口，PKMYT1的表达显著降低U8国际·科技赋能场景,更省心娱乐沐鸣2-科技赋能场景,让娱乐更有趣!在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅。体外转录实验发现IGF2BP3与PKMYT1 mRNA的结合能力在两个PKMYT1 m6A 修饰位点突变后明显下降澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)官方网站，表明IGF2BP3在维持PKMYT1 mRNA稳定性上的作用球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口杏XC彩sport·(中国)集团娱乐官方网站登录入口全站版。

6.體內ALKBH5、PKMYT1與IGF2BP3的相關性研究

通過組織微陣列和TCGA數據庫分析腫瘤遠處轉移組和淋巴結轉移組中PKMYT1和IGF2BP3的表達情況：轉移組IGF2BP3和PKMYT1表達明顯高于未轉移組；構建的裸鼠腫瘤肺轉移模型杏XC彩sport·(中国)集团娱乐官方网站登录入口全站版杏宇娱乐-杏宇注册登录平台，發現過表達ALKBH5使細胞形成肺轉移的能力降低U8国际·科技赋能场景,更省心娱乐沐鸣2-科技赋能场景,让娱乐更有趣!澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)官方网站，肺組織切片HE染色顯示轉移性結節數量顯著減少杏宇娱乐-杏宇注册登录平台，免疫組化結果發現PKMYT1表達明顯受到抑制熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站。敲除ALKBH5後觀察到相反的結果DB旗舰·(中国区)官方app网站有限公司官网杏XC彩sport·(中国)集团娱乐官方网站登录入口全站版在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅。

結論
研究确定ALKBH5是胃癌转移的肿瘤抑制因子沐鸣2-科技赋能场景,让娱乐更有趣!杏宇娱乐-杏宇注册登录平台澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)官方网站，并且这种作用依赖于ALKBH5的去甲基化酶活性澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)官方网站。PKMYT1是ALKBH5的下游靶基因且与ALKBH5表达呈负相关；PKMYT1经过m6A 修饰后球友会QY(千亿中国)有限公司-会员入口，蛋白IGF2BP3通过识别其 m6A  修饰位点帮助增强 PKMYT1 的 mRNA 稳定性杏耀平台娱乐注册(全站)登录入口手机APP下载熊猫体育【体育中国】官方直播平台认证网站U8国际·科技赋能场景,更省心娱乐，导致其更高的表达水平沐鸣2-科技赋能场景,让娱乐更有趣!，最终促进胃癌转移杏XC彩sport·(中国)集团娱乐官方网站登录入口全站版在线娱乐_用户注册(中国)娱乐中心首页大厅杏宇娱乐-杏宇注册登录平台。

參考文獻：

[1]Qin ZY, Wang T, Su S, Shen LT, Zhu GX, Liu Q, et al. BRD4 Promotes Gastric Cancer Progression and Metastasis through Acetylation-Dependent Stabilization of Snail. Cancer Res. 2019;79(19):4869–81.

[2] Kim J, Kim WH, Byeon SJ, Lee BL, Kim MA. Epigenetic Downregulation and Growth Inhibition of IGFBP7 in Gastric Cancer. Asian Pac J Cancer Prev.2018;19(3):667–75.

[3] Su R, Dong L, Li Y, Gao M, Han L, Wunderlich M, et al. Targeting FTO Suppresses Cancer Stem Cell Maintenance and Immune Evasion. Cancer Cell.2020;38(1):79–96 (e11).

[4] Song P, Feng L, Li J, Dai D, Zhu L, Wang C, et al. beta-catenin repressesmiR455-3p to stimulate m6A modifcation of HSF1 mRNA and promoteits translation in colorectal cancer. Mol Cancer. 2020;19(1):129.

[5] Yue B, Song C, Yang L, Cui R, Cheng X, Zhang Z, et al. METTL3-mediated N6-methyladenosine modifcation is critical for epithelial-mesenchymal transition and metastasis of gastric cancer. Mol Cancer. 2019;18(1):142

[6] Wang Q, Chen C, Ding Q, Zhao Y, Wang Z, Chen J, et al. METTL3-mediated m(6)A modifcation of HDGF mRNA promotes gastric cancer progression and has prognostic signifcance. Gut. 2020;69(7):1193–205

.[7] Huo FC, Zhu ZM, Zhu WT, Du QY, Liang J, Mou J. METTL3-mediated m(6)A methylation of SPHK2 promotes gastric cancer progression by targeting KLF2. Oncogene. 2021;40(16):2968–81.

[8] Yang Z, Jiang X, Li D, Jiang X. HBXIP promotes gastric cancer via METTL3-mediated MYC mRNA m6A modifcation. Aging (Albany NY). 2020;12(24):24967–82.