背景

肝內膽管癌（ICC）易转移且术后复发迅速U8国际·[官方网]有限公司官网熊猫体育【体育中国】直播平台官方网站long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口，预后较差U8国际·[集团]有限公司官网娱乐中心首页大厅,娱乐中心-大厅welcome沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2。肿瘤微环境中IL-6（白细胞介素）的异常表达使STAT3磷酸化并转移到细胞核中调控下游靶基因的转录U8国际·[官方网]有限公司官网，促进肿瘤细胞生长和转移MK(体育科技有限公司)体育·官方网站U8国际·[官方网]有限公司官网，且IL-6可以诱导非编码RNA表达促进肿瘤侵袭熊猫体育【体育中国】直播平台官方网站long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口。具有分子海绵作用的环状RNA（circRNA）作为非编码RNAU8国际·[官方网]有限公司官网娱乐中心首页大厅,娱乐中心-大厅welcome，部分具有内部核糖体进入位点（IRES）U8国际·[集团]有限公司官网，可以招募核糖体诱导蛋白质翻译U8国际·[集团]有限公司官网long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口，是癌症发生和转移的重要标志物娱乐中心首页大厅,娱乐中心-大厅welcomeU8国际·[官方网]有限公司官网。然而沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2，IL-6调控circRNAs等其他机制是否促进肿瘤的发生尚不清楚澳·门人威·尼·斯·娱·乐·(中国)集团娱乐官方网站娱乐中心首页大厅,娱乐中心-大厅welcome。来自四川大学华西医院吴泓、曾勇、袁克非课题组沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2熊猫体育【体育中国】直播平台官方网站，中山大学附属第三医院汪根树课题组在影响因子为17.421的Hepatology杂志上发表文章题目为“IL-6 induced cGGNBP2 encodes a novel protein to promote cell growth and metastasis in intrahepatic cholangiocarcinoma”的研究成果娱乐中心首页大厅,娱乐中心-大厅welcome，报道了一种IL-6诱导的circRNA（cGGNBP2）熊猫体育【体育中国】直播平台官方网站，并對其编码的新型蛋白（cGGNBP2-184aa）进行了表征澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)集团娱乐官方网站熊猫体育【体育中国】直播平台官方网站，研究了cGGNBP2-184aa在IL-6/STAT3信号传导和ICC转移中的作用澳·门人威·尼·斯·娱·乐·(中国)集团娱乐官方网站。諾禾致源在此提供专业的circRNA建庫測序和生信分析服务沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)集团娱乐官方网站long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口。

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1. IL-6使cGGNBP2上調MK(体育科技有限公司)体育·官方网站，與ICC病人預後相關

ICC患者血清中IL-6水平与较大的肿瘤大小、多发肿瘤数量、淋巴结浸润和不良预后显著相关MK(体育科技有限公司)体育·官方网站沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2U8国际·[集团]有限公司官网。對IL-6处理的RBE细胞进行circRNA測序U8国际·[集团]有限公司官网澳·门人威·尼·斯·娱·乐·(中国)集团娱乐官方网站login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台，共鉴定出3951个差异circRNA（3055个已知）login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台，9个显著上调MK(体育科技有限公司)体育·官方网站，7个显著下调MK(体育科技有限公司)体育·官方网站long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口澳·门人威·尼·斯·娱·乐·(中国)集团娱乐官方网站。qPCR、RNaseR對测序结果进行了验证long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口，发现circRNA GGNBP2（cGGNBP2）在IL-6处理的细胞中显著上调娱乐中心首页大厅,娱乐中心-大厅welcomeMK(体育科技有限公司)体育·官方网站login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台。在136對ICC肿瘤组织和癌旁组织中评估cGGNBP2的临床相关性沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台，发现cGGNBP2高表达与血清糖类抗原19-9水平升高、肿瘤大小增大、肿瘤数量增多、淋巴结转移和晚期肿瘤分期显著相关澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)集团娱乐官方网站沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2澳·门人威·尼·斯·娱·乐·(中国)集团娱乐官方网站，表明cGGNBP2被IL-6上调long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口MK(体育科技有限公司)体育·官方网站，可能作为ICC患者的预后因素澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)集团娱乐官方网站login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台U8国际·[集团]有限公司官网。

圖1  circRNA測序结果

2. DHX9調控cGGNBP2的表達

對IL-6处理的细胞进行RNA-seq发现与circRNA形成相关的RBPs DHX9可被IL-6下调；40例ICC患者肿瘤组织中DHX9的表达与血清IL-6水平呈负相关；136例ICC组织中cGGNBP2的表达与DHX9的组织化学评分呈负相关；DHX9沉默使cGGNBP2表达水平显著上调娱乐中心首页大厅,娱乐中心-大厅welcome。circRNA的成环机制受到内含子2和6的RCM（反向互补配對）的调控U8国际·[官方网]有限公司官网。RIP实验验证DHX9与核内ggnbp2基因pre-mRNA转录本内cGGNBP2的RCM结合从而增强转录后水平cGGNBP2的表达沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2。

圖2 cGGNBP2成环机制

3.闡明cGGNBP2生物學功能：cGGNBP2在體內外促進ICC細胞生長和轉移

體外敲除和過表達實驗表明cGGNBP2具有促進細胞增殖和細胞侵襲能力；在體內U8国际·[官方网]有限公司官网U8国际·[集团]有限公司官网，cGGNBP2的沈默可顯著抑制腫瘤生長沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口熊猫体育【体育中国】直播平台官方网站，過表達可加速腫瘤生長U8国际·[集团]有限公司官网long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口。小鼠肝移植和肺轉移模型中沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口，cGGNBP2基因敲除導致較少的轉移竈MK(体育科技有限公司)体育·官方网站娱乐中心首页大厅,娱乐中心-大厅welcomeU8国际·[官方网]有限公司官网，相反login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台U8国际·[集团]有限公司官网MK(体育科技有限公司)体育·官方网站，增強的cGGNBP2促進轉移U8国际·[集团]有限公司官网login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台。因此MK(体育科技有限公司)体育·官方网站澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)集团娱乐官方网站，cGGNBP2在體內外具有促進ICC細胞生長和轉移的功能U8国际·[官方网]有限公司官网MK(体育科技有限公司)体育·官方网站。

4.新機制挖掘：cGGNBP2編碼184個氨基酸的新型蛋白

通過circRNADb数据库鉴定出cGGNBP2的一个具有编码184aa蛋白潜能的高度保守的ORF和IRES序列U8国际·[集团]有限公司官网。質譜分析证实cGGNBP2编码184个氨基酸的蛋白质（cGGNBP2-184aa）澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)集团娱乐官方网站。根据其氨基酸序列（KKNKRCQLHSLDTHKPK）制备的抗体能够特异性识别GGNBP2和cGGNBP2-184aa澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)集团娱乐官方网站。与cGGNBP2一致熊猫体育【体育中国】直播平台官方网站login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台MK(体育科技有限公司)体育·官方网站，cGGNBP2-184aa可通過IL-6刺激以浓度和时间依赖性方式上调U8国际·[集团]有限公司官网沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2。

圖3 cGGNBP2的ORF与IRES

5.挖掘蛋白功能：cGGNBP2-184aa在體外促進ICC細胞生長和轉移

構建cGGNBP2-184aa-ORF表达载体long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)集团娱乐官方网站，以及IRES-MUT载体U8国际·[集团]有限公司官网。免疫荧光实验证实cGGNBP2-184aa主要位于细胞质内login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2。IRES-MUT细胞系中cGGNBP2表达量显著升高澳·门人威·尼·斯·娱·乐·(中国)集团娱乐官方网站娱乐中心首页大厅,娱乐中心-大厅welcome，cGGNBP2-184aa基本不变；过表达cGGNBP2-184aa-ORF的细胞系中cGGNBP2-184aa的表达显著增强login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)集团娱乐官方网站，而cGGNBP2不变澳·门人威·尼·斯·娱·乐·(中国)集团娱乐官方网站login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口。因此U8国际·[官方网]有限公司官网U8国际·[集团]有限公司官网澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)集团娱乐官方网站，是cGGNBP2-184aa表达上调而不是IRES-MUT cGGNBP2表达上调促进了ICC细胞增殖和转移熊猫体育【体育中国】直播平台官方网站。

圖4 cGGNBP2-184aa促進ICC細胞生長與轉移  

6.深入探討蛋白促進細胞生長的機制研究：cGGNBP2-184aa促進ICC細胞中STAT3磷酸化

IRES-MUT和OE-cGGNBP2过表达稳定细胞系的RNA-seq结果发现292个差异上调基因和240个差异下调基因沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台U8国际·[集团]有限公司官网。功能富集分析表明cGGNBP2-184aa过表达显著激活了JAK-STAT信号通路澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)集团娱乐官方网站澳·门人威·尼·斯·娱·乐·(中国)集团娱乐官方网站熊猫体育【体育中国】直播平台官方网站。STAT3是JAK-STAT途径的关键转录因子, cGGNBP2-184aa过表达显著促进了STAT3在Tyr705位点的磷酸化U8国际·[集团]有限公司官网熊猫体育【体育中国】直播平台官方网站long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口。亚细胞蛋白组分分析表明cGGNBP2-184aa过表达显著加速磷酸化的STAT3Tyr705的核易位MK(体育科技有限公司)体育·官方网站U8国际·[集团]有限公司官网login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台。双荧光素酶报告实验显示澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)集团娱乐官方网站娱乐中心首页大厅,娱乐中心-大厅welcome熊猫体育【体育中国】直播平台官方网站，cGGNBP2-184aa表过达显著增强STAT3反应元件的活性login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台。功能得失实验确定cGGNBP2-184aa增强的STAT3Tyr705磷酸化影响细胞增殖、迁移和侵袭娱乐中心首页大厅,娱乐中心-大厅welcome澳·门人威·尼·斯·娱·乐·(中国)集团娱乐官方网站login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台，表明IL-6/cGGNBP2-184aa/STAT3形成了一个正反馈回路long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口MK(体育科技有限公司)体育·官方网站。

圖5 cGGNBP2-184aa激活AK-STAT信号通路

7. 闡明cGGNBP2-184aa上調STAT3Tyr705磷酸化的機制：cGGNBP2-184aa與STAT3相互作用以促進其轉錄活性

質譜與IP實驗發現cGGNBP2-184aa和STAT3之間存在相互作用；共免疫沈澱實驗證明STAT3的DNA結合域（DBD）能夠結合cGGNBP2-184aa（62-122）澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)集团娱乐官方网站MK(体育科技有限公司)体育·官方网站沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2，cGGNBP2-184aa（62-122）增強了STAT3響應元件的熒光素酶活性和STAT3下遊基因的mRNA表達；且cGGNBP2-184aa誘導的細胞增殖和侵襲也歸因于cGGNBP2-184aa的相互作用區澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)集团娱乐官方网站U8国际·[集团]有限公司官网long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口。總之U8国际·[集团]有限公司官网娱乐中心首页大厅,娱乐中心-大厅welcome澳·门人威·尼·斯·娱·乐·(中国)集团娱乐官方网站，cGGNBP2-184aa與STAT3的DBD相互作用login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台，激活JAK-STAT信號澳·门人威·尼·斯·娱·乐·(中国)集团娱乐官方网站U8国际·[官方网]有限公司官网，在體外促進細胞增殖和轉移login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台。

圖6 IL-6/cGGNBP2-184aa/STAT3正反馈回路

8.cGGNBP2-184aa在體內的作用及臨床意義

在體內澳·门人威·尼·斯·娱·乐·(中国)集团娱乐官方网站，動物模型試驗表明cGGNBP2-184aa的過表達MK(体育科技有限公司)体育·官方网站，而不是cGGNBP2U8国际·[官方网]有限公司官网，可加速腫瘤生長U8国际·[集团]有限公司官网澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)集团娱乐官方网站，促進STAT3的磷酸化以及ICC細胞的肺轉移的肝轉移沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2娱乐中心首页大厅,娱乐中心-大厅welcome。136例ICC患者的STAT3Tyr705磷酸化水平檢測結果顯示cGGNBP2和STAT3Tyr705磷酸化之間顯著正相關；皮下注射IL-6後熊猫体育【体育中国】直播平台官方网站，與體外結果一致U8国际·[官方网]有限公司官网沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2娱乐中心首页大厅,娱乐中心-大厅welcome，IL-6刺激增加cGGNBP2-184aa表達和STAT3Tyr705磷酸化login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台，同時抑制體內凋亡程序login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台熊猫体育【体育中国】直播平台官方网站U8国际·[官方网]有限公司官网。注射IL-6中和抗體可逆轉IL-6的作用MK(体育科技有限公司)体育·官方网站熊猫体育【体育中国】直播平台官方网站long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口。

結論

CircRNA GGNBP2（cGGNBP2）通過IL-6处理以时间和浓度依赖性方式上调long8·龙8·(国际版)头号玩家唯一官方网站入口。cGGNBP2的生物发生受RNA结合蛋白DHX9调控；cGGNBP2编码的新蛋白-cGGNBP2-184aa在体内外促进ICC细胞增殖和转移澳门人威泥斯娱乐官方网站(中国)集团娱乐官方网站。在机制上MK(体育科技有限公司)体育·官方网站澳·门人威·尼·斯·娱·乐·(中国)集团娱乐官方网站，cGGNBP2-184aa直接与STAT3相互作用login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台，使STAT3磷酸化MK(体育科技有限公司)体育·官方网站澳·门人威·尼·斯·娱·乐·(中国)集团娱乐官方网站熊猫体育【体育中国】直播平台官方网站，并在调节IL-6/STAT3信号中发挥积极的调节作用MK(体育科技有限公司)体育·官方网站。IL-6/cGGNBP2-184aa/STAT3形成一个正反馈回路娱乐中心首页大厅,娱乐中心-大厅welcome澳·门人威·尼·斯·娱·乐·(中国)集团娱乐官方网站，以维持IL-6/STAT3信号的结构性激活MK(体育科技有限公司)体育·官方网站U8国际·[集团]有限公司官网。cGGNBP2表达升高与ICC患者预后不良相关U8国际·[官方网]有限公司官网，并被确定为患者预后的独立危险因素login_杏宇·(中国官方)代理招商直营平台，可作为ICC临床IL-6/STAT3靶向治疗的辅助靶点娱乐中心首页大厅,娱乐中心-大厅welcome沐鸣娱乐II（中国）官方平台资讯站_沐鸣娱乐2U8国际·[集团]有限公司官网。 

研究思路

參考文獻

[1] Li H., Lan T., Liu H.L., et al. IL-6 induced cGGNBP2 encodes a novel protein to promote cell growth and metastasis in intrahepatic cholangiocarcinoma. Hepatology. 2021. doi: 10.1002/hep.32232.