在基因編輯領域OG视讯·(中国区)有限公司官网网站，精確、高效地對特定DNA位点进行定向修改一直是科学家们追求的目标B体育(China)中国官方网站-B SPORTS。2024年1月31日发表于《Nature Biotechnology》的研究论文“Activation of recombinases at specific DNA loci by zinc-finger domain insertions”PA视讯(中国区)官网 - PlayAce，通过分子克隆、ChIP-seq、HiFi等多种技术手段kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站J9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌，将锌指DNA结合域（ZFDs）插入到重组酶编码序列中PA视讯(中国区)官网 - PlayAceDB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网，实现对重组酶靶向性和活性的革命性改进OG视讯·(中国区)有限公司官网网站。这一技术不仅将重组酶的定向编辑效率提高了四倍J9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌，并消除了哺乳动物细胞中可测量的脱靶活性DB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网。该工程化重组酶为基因编辑提供了更高的精确性和效率B体育(China)中国官方网站-B SPORTS意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台，展现了其在疗法开发中的巨大潜力B体育(China)中国官方网站-B SPORTSJ9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌PA视讯(中国区)官网 - PlayAce。文中ChIP-seq测序服务由諾禾致源提供kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站OG视讯·(中国区)有限公司官网网站B体育(China)中国官方网站-B SPORTS。

結果展示
N端和C端的ZF融合提高了重組酶的活性

爲了測試DNA结合域的融合是否可以改善Cre型工程重组酶的性质OG视讯·(中国区)官方平台网站，将ZFD（锌指结构域）融合到这些酶的N端或C端DB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网。建立了融合蛋白文库九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页）PA视讯(中国区)官网 - PlayAce，其中连接物的长度因Brec1和Zif268之间不同数量的柔性GGS重复(2-12)而变化意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台J9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页）。此外九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页），还创建了一个lox-zif靶点文库B体育(China)中国官方网站-B SPORTS，其中Brec1识别位点(loxBTR34 碱基对)和9-bpZif268结合基序之间的间距从0 BP到10 BP不等J9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台OG视讯·(中国区)官方平台网站。此外意昂5·Kgame(中国区)体育官方网站-EON SPORTSB体育(China)中国官方网站-B SPORTS，包括了Zif268结合序列相对于loxBTR半位点的两种不同取向意昂5·Kgame(中国区)体育官方网站-EON SPORTS。爲了測試所有276种可能的组合kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页），在大肠杆菌中表达了来自pEVO质粒2的目标位点文库上设计的融合复合体J9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌PA视讯(中国区)官网 - PlayAcekg体育官网视讯(中文站) - 官方网站，并通过计算重组与非重组质粒的比率来使用纳米孔测序来量化重组效率kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站PA视讯(中国区)官网 - PlayAceOG视讯·(中国区)官方平台网站。

結果表明PA视讯(中国区)官网 - PlayAceB体育(China)中国官方网站-B SPORTSkg体育官网视讯(中文站) - 官方网站，與非融合重組酶相比OG视讯·(中国区)官方平台网站，連接子長度、靶點間距和方向的最佳組合顯示出更高的重組率意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台，這可能是因爲ZFD與其位點的結合提供了對DNA的額外親和力B体育(China)中国官方网站-B SPORTS。N-末端和C-末端文庫的活性都得到了最大的提高kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站B体育(China)中国官方网站-B SPORTS意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台，當連接子的重複數爲12×GGSJ9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台，LOXBTR和ZIF結合基序之間的間隔子長度爲5 BPkg体育官网视讯(中文站) - 官方网站PA视讯(中国区)官网 - PlayAce，在低重組酶表達水平的質粒試驗中對最佳組合的測試顯示kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站，平均重組效率爲85%(C-末端Brec1-Zif268在loxBTR-5-ZIF(A)位點融合)九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页）DB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网PA视讯(中国区)官网 - PlayAce，而WT-Brec1在相同條件下平均重組質粒爲7%(圖1e-g)kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站。因此B体育(China)中国官方网站-B SPORTS意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台J9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌，ZFD的融合顯著提高了工程重組酶的重組效率九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页）J9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌OG视讯·(中国区)有限公司官网网站。

Cre-型重組酶五肽掃描誘變

産生ZF-重組酶融合的另一種可能的方法包括將ZFD序列插入到重組酶的編碼序列中九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页）OG视讯·(中国区)官方平台网站。然而九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页），這種插入融合可能會使酶失去功能九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页）。爲了確定工程重組酶中可以耐受小插入的位置意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台OG视讯·(中国区)有限公司官网网站，使用四種不同的重組酶進行了五肽掃描突變意昂5·Kgame(中国区)体育官方网站-EON SPORTSOG视讯·(中国区)有限公司官网网站J9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌。

繪制讀數圖顯示B体育(China)中国官方网站-B SPORTS意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台，Cre中的插入在許多位置都是耐受的DB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台OG视讯·(中国区)有限公司官网网站，反映了該酶對插入突變的穩健性B体育(China)中国官方网站-B SPORTS。相反B体育(China)中国官方网站-B SPORTSOG视讯·(中国区)有限公司官网网站，Cre衍生的重組酶沒有表現出相同的模式九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页）kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站，更少的區域允許插入這五個氨基酸PA视讯(中国区)官网 - PlayAceOG视讯·(中国区)官方平台网站B体育(China)中国官方网站-B SPORTS。然而kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站B体育(China)中国官方网站-B SPORTSJ9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌，Cre、Brec1、D7L和D7R的活性突變體在蛋白質的相同區域含有插入PA视讯(中国区)官网 - PlayAceOG视讯·(中国区)官方平台网站B体育(China)中国官方网站-B SPORTS，表明這些區域是潛在的通用插入位點九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页）。

插入式ZFD融合産生依赖于ZF的重组酶

在終端融合的基礎上DB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网，使用高通量篩選方法開發了與ZFD插入融合的体系意昂5·Kgame(中国区)体育官方网站-EON SPORTSkg体育官网视讯(中文站) - 官方网站意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台。在Brec1的278和279残基之间融合了Zif268意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台，使用了两个连接器DB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网OG视讯·(中国区)官方平台网站意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台，每个连接器由1-8个GGS重复序列组成九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页）J9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌，然后在先前开发的目标位点库的基础上表达了这个融合库意昂5·Kgame(中国区)体育官方网站-EON SPORTSPA视讯(中国区)官网 - PlayAceB体育(China)中国官方网站-B SPORTS。使用纳米孔测序技术对结果的1,472个组合进行了测试B体育(China)中国官方网站-B SPORTS。尽管五个氨基酸插入是兼容的PA视讯(中国区)官网 - PlayAceOG视讯·(中国区)有限公司官网网站，但所有携带插入式Zif268融合的变体在wt loxBTR上均无活性意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台，即使在高重组酶表达水平下也是如此kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站，这表明在G278和S279残基之间插入Zif268破坏了Brec1的活性意昂5·Kgame(中国区)体育官方网站-EON SPORTSkg体育官网视讯(中文站) - 官方网站。

在基于質粒的試驗中測試了Zif268 与 8×GGS 连接子融合的最佳变体DB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网B体育(China)中国官方网站-B SPORTSPA视讯(中国区)官网 - PlayAce，以下简称为 Brec1278-Zif268PA视讯(中国区)官网 - PlayAce意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台OG视讯·(中国区)官方平台网站。与筛选结果一致的是OG视讯·(中国区)官方平台网站PA视讯(中国区)官网 - PlayAceOG视讯·(中国区)有限公司官网网站，即使在 200 µg ml-1 ?-arabinose 的高诱导水平下意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站OG视讯·(中国区)有限公司官网网站，Brec1278-Zif268 融合体在wt loxBTR上的活性也受到了影响kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站OG视讯·(中国区)有限公司官网网站，但在 loxBTR-5-zif (B) 位点上却恢复了全部活性J9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌。因此J9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台，插入式 ZFD 融合産生的重组酶依赖于 ZFD 与其目标序列的结合而具有重组活性PA视讯(中国区)官网 - PlayAceB体育(China)中国官方网站-B SPORTSOG视讯·(中国区)官方平台网站。

基因組位點 ZFD 的设计和定向进化

測試了單體（D7L和D7R）與設計的ZFD在相應對稱位點（loxF8L和loxF8R）以及包括20個堿基對基因組側翼序列的擴展版本（loxF8L-flank和loxF8R-flank）上的融合體的活性J9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌。與之前的結果一致OG视讯·(中国区)有限公司官网网站，沒有任何被測試的複合物在loxF8L和loxF8R上顯示活性PA视讯(中国区)官网 - PlayAce。相反J9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站OG视讯·(中国区)官方平台网站，兩個融合體（D7L-ZFL1和D7R-ZFR4）在擴展的目標位點上顯示了活性J9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌，盡管與非融合的重組酶相比效率較低PA视讯(中国区)官网 - PlayAceB体育(China)中国官方网站-B SPORTS。爲了改進設計的ZFDs意昂5·Kgame(中国区)体育官方网站-EON SPORTSPA视讯(中国区)官网 - PlayAceB体育(China)中国官方网站-B SPORTS，采用成熟的底物連接的定向進化（SLiDE）協議來進行ZFDs的定向進化九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页）B体育(China)中国官方网站-B SPORTS。創建了隨機突變的ZFL1和ZFR4的文庫意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台，並將這些文庫克隆到一個修改過的進化載體中意昂5·Kgame(中国区)体育官方网站-EON SPORTSOG视讯·(中国区)有限公司官网网站，其中包含重組酶序列和相應的目標位點OG视讯·(中国区)官方平台网站。進行了20個循環的突變、選擇和反選擇B体育(China)中国官方网站-B SPORTS，以改善ZFD與側翼位點的特異性結合DB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台意昂5·Kgame(中国区)体育官方网站-EON SPORTS，並觀察到最終文庫在擴展的目標位點上的重組活性顯著增加意昂5·Kgame(中国区)体育官方网站-EON SPORTSOG视讯·(中国区)官方平台网站J9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌，表明具有改進特性的ZFDs已經進化出來九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页）。

D7-ZF 具有更好的应用性能

爲了進一步研究 D7-ZF 可能的改进九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页）OG视讯·(中国区)官方平台网站，我们在人类基因组偏离目标 HG2 和 HG2L 上进行了测试意昂5·Kgame(中国区)体育官方网站-EON SPORTSDB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页），这些偏离目标以前曾报道过被 D7 异源二聚体重组意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页）OG视讯·(中国区)有限公司官网网站。与 D7 不同的是B体育(China)中国官方网站-B SPORTSOG视讯·(中国区)有限公司官网网站九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页），D7-ZF 在这些非靶标或其扩展版本（包括 34-bp pseudo-loxF8 位点上游和下游的基因组序列）上没有观察到活性意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台B体育(China)中国官方网站-B SPORTS。对 D7 和 D7-ZF 在八个已确定的潜在人类非靶点（HGZF1-8）上进行了测试意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台意昂5·Kgame(中国区)体育官方网站-EON SPORTSOG视讯·(中国区)有限公司官网网站。D7 重组了其中的两个非靶点（HGZF4 和 HGZF5）意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台，而 D7-ZF 在任何一个位点上都没有检测到重组活性B体育(China)中国官方网站-B SPORTSJ9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌PA视讯(中国区)官网 - PlayAce，这证明了它的高度特异性九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页），并表明这种方法不会导致新的非靶点B体育(China)中国官方网站-B SPORTS。

這些結果表明B体育(China)中国官方网站-B SPORTS意昂5·Kgame(中国区)体育官方网站-EON SPORTS，在具有治療潛力的工程化重組酶中插入ZFD融合體可以改善其應用特性意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台J9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌。證明了D7-ZF的改進性能J9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌，使其成爲未來治療開發的首選候選藥物九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页）DB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网。

ZFD-重組酶融合具有寬松的特異性

RecFlex能夠重組一系列類lox位點OG视讯·(中国区)有限公司官网网站PA视讯(中国区)官网 - PlayAce意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台，包括loxFlex1、loxFlex2、loxFlex3、loxFlex4和loxFlex5kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站DB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台，它們每半個位點相差6-9 bpOG视讯·(中国区)官方平台网站。這些靶點之間只顯示出31-54%的序列相似性意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台，這表明RecFlex具有重組數千個不同的靶序列的潛力意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台OG视讯·(中国区)有限公司官网网站。通過對人類基因組中出現的loxFlex基序的廣泛研究B体育(China)中国官方网站-B SPORTSDB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网，成功地定位了位于人類X染色體上MECP2基因座(LoxMECP2)內的臨床相關的RecFlex樣靶位置九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页）kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站。

結果表明OG视讯·(中国区)有限公司官网网站意昂5·Kgame(中国区)体育官方网站-EON SPORTSB体育(China)中国官方网站-B SPORTS，通過將寬松的特異性重組酶與插入的ZFD融合意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台，這種方法可以在較短的時間內實現具有部分定制的特異性的工程重組酶的編程DB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网。

該研究結果對未來的基因組編輯應用具有重要意義九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页）DB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网意昂5·Kgame(中国区)体育官方网站-EON SPORTS，特別是在開發具有寬松特異性的工程重組酶DB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网OG视讯·(中国区)有限公司官网网站，可以針對多個位點PA视讯(中国区)官网 - PlayAceB体育(China)中国官方网站-B SPORTS。本文中寬松特異性重組酶RecFlex是這類酶的原型九游·会(J.9)集团官网 - 真人游戏第一品牌（首页）PA视讯(中国区)官网 - PlayAceB体育(China)中国官方网站-B SPORTS。雖然RecFlex目前不能成爲一種完全可編程的重組酶OG视讯·(中国区)官方平台网站DB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网B体育(China)中国官方网站-B SPORTS，但我們設想kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站意昂4凯捷体育(中国)数字娱乐技术创新平台DB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网，放松特異性重組酶庫的篩選將識別出可以覆蓋人類基因組任何序列的酶意昂5·Kgame(中国区)体育官方网站-EON SPORTSkg体育官网视讯(中文站) - 官方网站PA视讯(中国区)官网 - PlayAce，並可以與插入的ZFD結合生成先進的基因組編輯酶kg体育官网视讯(中文站) - 官方网站J9九游|会(中国)最新J.9官网网站-真人游戏第一品牌DB真人旗舰·(中国官方)集团有限公司官网。

參考文獻：

[1] Mukhametzyanova, L., Schmitt, L.T., Torres-Rivera, J. et al. Activation of recombinases at specific DNA loci by zinc-finger domain insertions. Nat Biotechnol (2024).