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High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity
文章雜志：Nature Biotechnology
影響因子：46.9
文章單位：哈佛大學化學系化學生物學和霍華德休斯醫學研究所
發表年份：2013年
一、研究背景
CRISPR/Cas9 是一种来源于细菌获得性免疫的由 RNA 指导 Cas9 蛋白对靶向基因进行修饰的技术乐天堂fun88·（官网）娱乐中心 -我的账户球客岛_球客直播_足球直播_体育直播_nba直播_球客岛zoty中欧·(中国集团公司)官方网站。CRISPR/Cas9 与靶位点识别的特异性主要依赖于 gRNA 靠近 PAM 处10~12 bp 碱基的配对
二、技術路線
CLTA 基因的四个不同靶位点beat365中文官方网站[官网]-正版App Store杏宇娱乐-杏宇注册登录平台zoty中欧·(中国集团公司)官方网站， 每个设计2条共8条 gRNA球客岛_球客直播_足球直播_体育直播_nba直播_球客岛。
每个 DNA 底物文库包含1012个潜在的 脱靶 DNA 序列杏宇娱乐-杏宇注册登录平台乐天堂fun88·（官网）娱乐中心 -我的账户熊猫体育中国(官方认证）体育赛事直播平台，进行高通量测序PA电子官方-游戏试玩|PLAYACE GAMEvsport-(中国区)官方网站zoty中欧·(中国集团公司)官方网站。
1. 不同长度 gRNA 活性比较
2. 脱靶效率
3. CRISPR/Cas9 的特异性与
gRNA 序列中的种子序列长度关系
三、研究結果
1. CLTA 基因的4個靶位都存在脫靶現象
該研究對 CLTA 基因的4个不同靶位点设计8条不同序列的 gRNA球客岛_球客直播_足球直播_体育直播_nba直播_球客岛，8个 gRNA:Cas9复合物球客岛_球客直播_足球直播_体育直播_nba直播_球客岛杏宇娱乐-杏宇注册登录平台，可切割1012个潜在的脱靶 DNA 序列bsports(中国区)B—sports体育登录入口PA电子官方-游戏试玩|PLAYACE GAME，通过体外筛选与高通量测序乐天堂fun88·（官网）娱乐中心 -我的账户杏宇娱乐-杏宇注册登录平台，发现4个靶位点均存在脱靶现象杏宇娱乐-杏宇注册登录平台，脱靶效率最高可达84%熊猫体育中国(官方认证）体育赛事直播平台bsports(中国区)B—sports体育登录入口杏宇娱乐-杏宇注册登录平台。
2. CRISPR/Cas9 的特异性低
与以前的研究结果对比熊猫体育中国(官方认证）体育赛事直播平台，本研究得出 CRISPR/Cas9 的特异性仅与 gRNA 配对的靠近PAM 处7~12 bp 碱基相关vsport-(中国区)官方网站。
3. 在体外和细胞中 gRNA 的活性和特异性
该研究在体外选择中检测了两种长度不同 gRNA 结构bsports(中国区)B—sports体育登录入口，发现长度短的 gRNA 比长度长的 gRNA 特异性更高bsports(中国区)B—sports体育登录入口乐天堂fun88·（官网）娱乐中心 -我的账户vsport-(中国区)官方网站，而活性却较低球客岛_球客直播_足球直播_体育直播_nba直播_球客岛。虽然 gRNA:Cas9 混合物浓度的提高会提高 Cas9 的切割活性vsport-(中国区)官方网站，但是进一步降低了 gRNA:Cas9 混合物打靶的准确性bsports(中国区)B—sports体育登录入口。
四、研究結論
该研究揭示了 Cas9 能够导向其编程靶向的 DNA 序列的精确度熊猫体育中国(官方认证）体育赛事直播平台杏鑫平台|杏鑫娱乐-专为杏鑫提供注册登录服务的网站zoty中欧·(中国集团公司)官方网站，与 sgRNA 结构在 DNA裂解特异性中的未知作用beat365中文官方网站[官网]-正版App Store。本研究揭示的原理可能也适用于基于 Cas9 的效应子PA电子官方-游戏试玩|PLAYACE GAMEbeat365中文官方网站[官网]-正版App Store，这些效应子被设计用于介导 DNA 分裂以外的调节功能杏宇娱乐-杏宇注册登录平台。
案例二 在水稻中能产生全基因组脱靶突变的是胞嘧啶碱基编辑器而非腺嘌呤碱基编辑器
Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice
文章雜志：Science
影響因子：56.9
文章单位：中國科学院遗传发育所高彩霞课题组
發表年份：2019年
一、研究背景
单核苷酸变化是人类疾病和经济作物性状变异的重要原因zoty中欧·(中国集团公司)官方网站杏鑫平台|杏鑫娱乐-专为杏鑫提供注册登录服务的网站乐天堂fun88·（官网）娱乐中心 -我的账户。不管是 CRISPR/Cas9 还是 CRISPR/Cpf1 基因组编辑技术杏鑫平台|杏鑫娱乐-专为杏鑫提供注册登录服务的网站，都是可以通过 DNA 片段的插入或删除来调节基因的功能vsport-(中国区)官方网站PA电子官方-游戏试玩|PLAYACE GAME球客岛_球客直播_足球直播_体育直播_nba直播_球客岛，难以有效地修正单个核苷酸beat365中文官方网站[官网]-正版App Store球客岛_球客直播_足球直播_体育直播_nba直播_球客岛。目前已开发出的胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）是将切口酶型 Cas9 蛋白（nCas9）与胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶融合在一起形成的乐天堂fun88·（官网）娱乐中心 -我的账户zoty中欧·(中国集团公司)官方网站杏鑫平台|杏鑫娱乐-专为杏鑫提供注册登录服务的网站，并且发现它们在单向导 RNA（sgRNA）的靶位点中促进 C>T 或 A>G 转化beat365中文官方网站[官网]-正版App Storezoty中欧·(中国集团公司)官方网站杏宇娱乐-杏宇注册登录平台。
二、技術路線
选择3种剪辑编辑器：BE3、 高保真 BE3、ABE
45株编辑植株乐天堂fun88·（官网）娱乐中心 -我的账户熊猫体育中国(官方认证）体育赛事直播平台球客岛_球客直播_足球直播_体育直播_nba直播_球客岛，11株不带有
sgRNA 的转化植株zoty中欧·(中国集团公司)官方网站，
9株对照植株进行全基因組測序vsport-(中国区)官方网站，
測序深度60×乐天堂fun88·（官网）娱乐中心 -我的账户。
不同堿基編輯器轉化植株及對照組的全基因組突變類型（SNV、indel）
三、研究結果
1. BE3 组、HF1-BE3 组、ABE 组和对照组产生 indel 数量上没有显著差异bsports(中国区)B—sports体育登录入口。BE3 组和 HF1-BE3 组都在水稻基因组中造成大量的单核苷酸变异（SNVs）beat365中文官方网站[官网]-正版App Store杏宇娱乐-杏宇注册登录平台，且大部分为 C>T 类型的碱基突变乐天堂fun88·（官网）娱乐中心 -我的账户熊猫体育中国(官方认证）体育赛事直播平台。
2. 这些脱靶突变vsport-(中国区)官方网站，主要是 C> T 类型杏鑫平台|杏鑫娱乐-专为杏鑫提供注册登录服务的网站，并且在转录的基因区域中富集杏鑫平台|杏鑫娱乐-专为杏鑫提供注册登录服务的网站杏宇娱乐-杏宇注册登录平台，同时这些突变又不能通过目前脱靶软件（Cas-OFFinder）预测到乐天堂fun88·（官网）娱乐中心 -我的账户bsports(中国区)B—sports体育登录入口。
3. ABE 系统表现出非常高的特异性熊猫体育中国(官方认证）体育赛事直播平台球客岛_球客直播_足球直播_体育直播_nba直播_球客岛PA电子官方-游戏试玩|PLAYACE GAME。ABE 处理的植株与对照植株在全基因组范围内的 SNVs 数量基本一致PA电子官方-游戏试玩|PLAYACE GAME杏鑫平台|杏鑫娱乐-专为杏鑫提供注册登录服务的网站zoty中欧·(中国集团公司)官方网站。
综上杏宇娱乐-杏宇注册登录平台，该研究表明现有 BE3 和 HF1-BE3 系统球客岛_球客直播_足球直播_体育直播_nba直播_球客岛熊猫体育中国(官方认证）体育赛事直播平台beat365中文官方网站[官网]-正版App Store，而非 ABE 系统乐天堂fun88·（官网）娱乐中心 -我的账户杏鑫平台|杏鑫娱乐-专为杏鑫提供注册登录服务的网站，可在植物体内造成难以预测的脱靶突变杏宇娱乐-杏宇注册登录平台bsports(中国区)B—sports体育登录入口PA电子官方-游戏试玩|PLAYACE GAME，因此bsports(中国区)B—sports体育登录入口杏鑫平台|杏鑫娱乐-专为杏鑫提供注册登录服务的网站PA电子官方-游戏试玩|PLAYACE GAME，需要进一步优化提高其特异性杏宇娱乐-杏宇注册登录平台杏鑫平台|杏鑫娱乐-专为杏鑫提供注册登录服务的网站vsport-(中国区)官方网站。
四、研究結論
1. 首次在体内利用全基因組測序技术全面分析和比较了这三种单碱基编辑系统在基因组水平上的脱靶效应beat365中文官方网站[官网]-正版App Store杏鑫平台|杏鑫娱乐-专为杏鑫提供注册登录服务的网站。
2. 选用了 BE3、HF1-BE3 或 ABE 编辑和只用编辑器转化没有 sgRNA 的 T0植物和9个经历转化过程但没有 T-DNA 整合的植物杏宇娱乐-杏宇注册登录平台beat365中文官方网站[官网]-正版App Store杏鑫平台|杏鑫娱乐-专为杏鑫提供注册登录服务的网站，以及12个野生型植物过滤掉背景杏宇娱乐-杏宇注册登录平台乐天堂fun88·（官网）娱乐中心 -我的账户。
3. 该研究明确了不同单碱基编辑工具的脱靶特性杏鑫平台|杏鑫娱乐-专为杏鑫提供注册登录服务的网站zoty中欧·(中国集团公司)官方网站乐天堂fun88·（官网）娱乐中心 -我的账户，对单碱基编辑工具的应用和选择具有重要的指导意义bsports(中国区)B—sports体育登录入口beat365中文官方网站[官网]-正版App Store乐天堂fun88·（官网）娱乐中心 -我的账户。
參考文獻
[1] Pattanayak V, Lin S, Guilinger J P, et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity[J].Nature Biotechnology, 2013, 31(9):839-843.
[2] Jin S, Zong Y, Gao Q, et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice[J]. Science, 2019, 364(6437):292-295.
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